ภาพขั้นตอนการตรวจเชื้อไวรัส ตัวแดงดวงขาว ด้วยเทคนิค พีซีอาร์

   
 

ความหมาย และความเป็นมาของ พีซีอาร์

 

     หลายท่านในวงการกุ้งคงเคยได้ยินคำว่า "ตรวจตัวแดง" หรือ "ตรวจ พีซีอาร์" สงสัยมั๊ยครับว่า ความหมายคืออะไร? และตรวจกันอย่างไร? เนื้อหาและภาพถ่ายที่ผมได้รับอนุญาตให้เข้าบันทึกภาพ คงช่วยตอบคำถามเหล่านี้ได้ครับ แต่ผมคงไม่ลงลึกในรายละเอียดทางวิชาการมากนัก เพราะ เนื้อหาจะเยอะมาก และผมจะพยายามใช้คำศัพท์ที่ง่ายๆ ครับ หากนักวิชาการท่านใดเห็นว่ามีข้อผิดพลาด กรุณาส่งเมล์มาแจ้งด้วยนะครับ จะขอบพระคุณยิ่ง (เว็บมาสเตอร์)

      การตรวจไวรัส ตัวแดงดวงขาว ทำโดยการครวจสารพันธุกรรม ดีเอ็นเอ หรือ DNA (deoxyribonucleic acid) คงเคยได้ยินชื่อกันนะครับ แบบที่หาการเป็นพ่อ แม่ ลูก นะครับ แต่สมัยก่อนทำยากเพราะ DNA ที่สกัดได้มีจำนวนน้อยมาก

     จนกระทั่งในปี พ.ศ. 2528 ดอกเตอร์ Kary Mullis ได้เสนอผลงานวิจัยเกี่ยวกับ "การเพิ่มสารพันธุกรรม หรือ DNA ในหลอดทดลอง" ด้วยปฏิกริยา Polymerase Chain Reaction หรือ PCR ที่สามารถเพิ่มปริมาณ ดีเอ็นเอ ได้เป็นล้านเท่า ทำให้การครวจสารพันธุกรรม ดีเอ็นเอ ทำได้ง่ายขึ้น (ภายหลัง ดอกเตอร์ท่านนี้ได้รางวัล โนเบล ด้วยครับ) และการนำ พีซีอาร์ มาใช้ก็เริ่มในปี พ.ศ. 2530

    ปัจจุบัน เทคนิคด้าน พีซีอาร์ ก้าวหน้าและพัฒนามากขึ้นและมีหลายแบบ ลองมาชมวิธีที่ น้องๆ ห้อง พีซีอาร์ ของศูนย์วิจัยและพัฒนาประมงชายฝั่งจันทบุรี ใช้อยู่ครับ

 
   

1. ทำให้ ดีเอ็นเอ ออกจากตัวอย่างกุ้งมาอยู่ในน้ำ

นำชิ้นส่วนตัวอย่างกุ้ง ที่บดแล้วมาใส่ในหลอด เติมน้ำ DW และใช้แท่งแก้วบดให้เข้ากัน (อุปกรณ์ทุกอย่างแยกกัน ใช้ครั้งเดียว หรือ ทำความสะอาดอบฆ่าเชื้อ)
นำมาเข้าเครื่องปั่นเหวี่ยง ที่ 10000 rpm 10 นาที
ออกจากเครื่องปั่นแล้วจะได้ตามภาพครับ ตอนนี้ ดีเอ็นเอ อยู่ในน้ำ DW นะครับ ส่วนที่เห็นเป็นตะกอนสีน้ำตาล คือ ชิ้นส่วนกุ้งครับ
   

2. การสกัด ดีเอ็นเอ ด้วย ไอโซโคด สติ๊ก

การสกัด ดีเอ็นเอ จากของเหลวในหลอดข้างบน มีหลายวิธี ทางศูนย์ ฯ ใช้วิธีสกัดด้วย ไอโซโคด สติ๊ก (ลูกศรชี้)
สกัด ดีเอ็นเอ โดยดูดของเหลวจากหลอดข้างบนที่ผ่านการปั่นเหวี่ยง จำนวน 8 ไมโครลิตร หยดลงบนแผ่น ไอโซโคด (ดูดเฉพาะส่วนใส)
นำแผ่นไอโซโคด ที่มี ดีเอ็นเอ จากตัวอย่างกุ้ง ใส่ในหลอดใหม่ (ไม่มีน้ำ)
นำหลอดที่มีแผ่นไอโซโคด (ที่มีดีเอ็นเอ) ไปอบในตู้อบ อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส 15-20 นาที
นำหลอดออกจากตู้อบ เติมน้ำ 500 ไมโครลิตร
สั่นหลอดด้วยเครื่อง 5 วินาที (ในภาพจะเห็นสีขาวก้นหลอด คือ ไอโซโคด สติ๊ก)
   

3. การทำดีเอ็นเอต้นแบบ (ดีเอ็นเอเทมเพลท)

ใช้ ฟอร์เซป จับ ไอโซโคด ที่ยังคงมี ดีเอ็นเอ ติดอยู่ จากหลอดข้างบน ใส่ในหลอดใหม่
เติมน้ำลงหลอดใหม่ 100 ไมโครลิตร
นำหลอดเข้าเครื่อง เทอร์โมไซเคิล ที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียส 30 นาที (ขั้นตอนการอุ่น)
จากนั้น นำหลอดมาสั่น ด้วยเครื่อง 60 ครั้ง ใน 1 นาที
ใช้ ฟอร์เซป จับ ไอโซโคดทิ้งไป เนื่องจากตอนนี้ ดีเอ็นเอ หลุดออกมาอยู่ในน้ำแล้ว เรียกว่า ดีเอ็นเอต้นแบบ (ดีเอ็นเอเทมเพลท)
   

4. การเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอ(ต้นแบบ) ด้วยเทคนิคพีซีอาร์

     ผสมค๊อกเทล (ไม่ใช่เหล้านะครับ) ที่สำคัญ ได้แก่ PCR Buffer Solution, dNTP mixture, Primer, Tag DNA Polymerase ได้ปริมาตรรวม 45 ไมโครลิตร ใส่หลอดใหม่

     จากนั้นดูด ดีเอ็นเอต้นแบบ (ดีเอ็นเอเทมเพลท) ที่ได้จากข้างบน ผสมลงไป 5 ไมโครลิตร (ค๊อกเทลจะมีส่วนช่วยในการเพิ่มปริมาณ ดีเอ็นเอ)

นำหลอด (ที่มี ค๊อกเทลผสมกับ ดีเอ็นเอต้นแบบ) เข้า เครื่องเทอร์โมไซเคิล ที่อุณหภูมิ 3 ระดับ คือ 95, 55 และ 72 องศาเซลเซียส 30 รอบ เวลารวมประมาณ 1 ชั่วโมง และจบที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส (ตรงนี้แหละคือ พีซีอาร์ เป็นการเพิ่มปริมาณ ดีเอ็นเอ) บางคนเลยเรียก เครื่องเทอร์โมไซเคิล ว่า เครื่องพีซีอาร์
นำหลอดออกจากเครื่องเทอร์โมไซเคิล วางบนน้ำแข็งเพื่อรักษาอุณหภูมิ ตอนนี้ ดีเอ็นเอ ที่อยู่ในหลอดมีปริมาณเพิ่มขึ้นเป็นล้านเท่า เรียกว่า ดีเอ็นเอโปรดักท์ (กลไกการเพิ่มปริมาณของ ดีเอ็นเอ มีรายละเอียดมาก ไม่สามารถนำลงได้ครับ)
   

5. การวิเคราะห์ ดีเอ็นเอ ด้วยวิธี Agarose Gel Electrophoresis

หยด สี บนแผ่น Parafilm
ใช้ ไมโครปิเปต ดูด ดีเอ็นเอโปรดักท์ จากหลอดข้างบน
ผสม ดีเอ็นเอโปรดักท์ กับหยดสีที่เตรียมไว้ (1 หยดต่อ 1 ตัวอย่าง จะไม่มีการปนเปื้อน) เราผสมสีกับ ดีเอ็นเอ เพื่อติดตามการเคลื่อนที่ของ ดีเอ็นเอ ครับ
โหลดลงบน แผ่นเจล ที่เตรียมไว้แล้วในเครื่องอิเลคโตรโฟรีซิส (การเตรียมเจลก็คล้ายๆกับการทำวุ้นที่รับประทานกันนั่นแหละครับ เพียงแต่ใช้ TBE บัฟเฟอร์ แทนน้ำเพื่อการนำไฟฟ้าที่ดี และวุ้นก็เป็นแบบพิเศษ)
โหลด ดีเอ็นเอโปรดักส์ ของตัวอย่างกุ้งครบแล้ว (ที่เห็นเป็นจุดน้ำเงิน) ส่วนด้านขวาสุด เป็น มาร์คเกอร์ สำหรับบอกตำแหน่งแถบการเคลื่อนที่ของ ดีเอ็นเอ จุดถัดมาคือ คอนโทรลบวก (หรือพูดง่ายๆ คือเชื้อตัวแดง เพื่อตรวจสอบความถูกต้อง)
เครื่องอิเลคโตรโฟรีซิส กำลังทำงานเพื่อตรวจสอบ ดีเอ็นเอ ซึ่งมีหลักการคือ ทำให้ ดีเอ็นเอ เคลื่อนที่ด้วยไฟฟ้ากระแสตรงจากขั้วบวกและลบ ซึ่งขนาดของดีเอ็นเอที่ต่างกัน จะทำให้ ความเร็วในการเคลื่อนที่ต่างกัน ดังนั้นระยะทางที่เคลื่อนที่ได้ ก็สามารถแยกชนิดของ ดีเอ็นเอได้ (มองเห็นจากแถบ หรือ Band)
เสร็จแล้วครับ ดีเอ็นเอ เคลื่อนที่แล้ว (สีฟ้าคือ จุดที่โหลดไว้ตอนแรก สีม่วง คือ การเคลื่อนที่ของ ดีเอ็นเอ)
ตอนนี้ต้องนำเจลออกจากเครื่องอิเลคโตรโฟรีซิส แช่ใน Gel Star เก็บในตู้เย็น นาน 30 นาที (ขั้นตอนนี้คือการย้อมสี ดีเอ็นเอ หรือ Nucleic Acid Gel stain) จะทำให้เห็น แถบ หรือ Band ได้ชัด
   

6. การอ่านผลจากแถบการเคลื่อนที่ของ ดีเอ็นเอ ด้วยแสงยูวี

ครบ 30 นาที นำเจลออกจากที่แช่ไว้ใน Gel Star
วางแผ่นเจลบนเครื่อง ยูวี
แผ่นเจลในสภาพที่พร้อมอ่านผล (ลูกศร)
อ่านผลด้วยแสงยูวี (แบบนี้ทำให้ดูได้เพียงครั้งเดียวตอนถ่ายภาพครับ เพราะแสงยูวีเข้มอันตรายมาก อ่านผลจริงเรามี "กล่องดำ" ป้องกันอีกชั้นครับ)
แถบ (Band) ที่มองเห็นใต้แสงยูวี ขวามือ คือ มาร์คเกอร์ (ภาพนี้ถ่ายไม่ชัดครับ ที่เห็นจริงจะแยกเป็นแถบห่างกัน) ถัดมา คอนโทรลบวก ซ้ายมือ 8 แถบ คือ ตัวอย่างกุ้ง
 
  จะเห็นได้ว่า ขั้นตอนการทำค่อนข้างยุ่งยาก และน้องๆ ทีมงานทำงานภายใต้สภาวะเสี่ยง กับสารเคมีที่เป็นอันตราย และแสงยูวี ดังนั้นหากการรายงานผลการตรวจของเราที่รายงานทางโทรศัพท์ มีความล่าช้าจากการโอนสายหรือจากระบบโทรศัพท์ ก็กรุณาให้อภัยด้วยนะครับ และขอสงวนสิทธิ์ สำหรับภาพถ่ายทั้งหมดครับ
 
ศูนย์วิจัยและและพัฒนาประมงชายฝั่งจันทบุรี
ตำบล บางกะจะ อำเภอเมือง จังหวัด จันทบุรี 22000
โทร 0-3945-7987-8 โทรสาร 0-3939-1025
email : crchantaburi@dof.thaigov.net หรือ chanfisheries@yahoo.com